親和層析親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結(jié)合而滯留，其他雜蛋白會(huì)流過(guò)柱子。本方法存在的問(wèn)題是：?jiǎn)慰狗浅０嘿F，而且也需先純化；單抗與目的蛋白結(jié)合力太強(qiáng).要用苛刻的條件來(lái)洗脫，這會(huì)使目的蛋白失活并破壞單抗；混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破壞抗體或與它們非特異結(jié)合；某些單抗也會(huì)在純化過(guò)程中從樹(shù)脂上解離下來(lái)混入產(chǎn)物中，也需要從終產(chǎn)物中去除。親和柱通常在純化過(guò)程的后期應(yīng)用，此時(shí)標(biāo)本體積已縮小，大部分的雜質(zhì)已經(jīng)去除。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GlutathioneS-transferase，GST）是最常用的親和層析純化標(biāo)簽之一，帶有此標(biāo)簽的重組蛋白可用交聯(lián)谷胱甘肽的層析介質(zhì)純化，但本方法有以下缺點(diǎn)：首先，蛋白上的GST必須能合適地折疊，形成與谷胱甘肽結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)才能用此方法純化；其次，GST標(biāo)簽多達(dá)220個(gè)氨基酸，如此大的標(biāo)簽可能會(huì)影響表達(dá)蛋白的可溶性，使形成包涵體，這會(huì)破壞蛋白的天然結(jié)構(gòu)，難于進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，有時(shí)即便純化后再酶切去除GST標(biāo)簽也不一定能解決問(wèn)題。另一種可應(yīng)用的親和純化標(biāo)簽是6組氨酸標(biāo)簽，組氨酸的咪唑側(cè)鏈可親和結(jié)合鎳、鋅和鈷等金屬離子，在中性和弱堿性條件下帶組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白與鎳柱結(jié)合，在低pH下用咪唑競(jìng)爭(zhēng)洗脫。

    什么叫透析法純化蛋白質(zhì)？為什么要用緩沖液？江蘇蛋白純化

    離子交換色譜這是在所有的蛋白純化與濃縮方法中***方法[4,51?；诘鞍着c離子交換樹(shù)脂間的相互電荷作用，通過(guò)選擇不同的緩沖液，同-種蛋白既可以和陰離子交換樹(shù)脂(能結(jié)合帶負(fù)電荷的分子)結(jié)合，也可以和陽(yáng)高子交換樹(shù)脂結(jié)合。樹(shù)脂所用的帶電基團(tuán)有四種:二乙基氨基乙基用于弱的陰離子交換樹(shù)脂;羧甲基用于弱的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂;季銨用于強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂;甲基磺酸酯用于強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。蛋白質(zhì)由氨基酸組成，氨基酸在不同的pH環(huán)境中所帶總電荷不同。大多數(shù)蛋白在生理pH(pH6--8)下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會(huì)變性失活.應(yīng)盡量避免。由于在某個(gè)特定的pH下不同的蛋白所帶電荷數(shù)不同，與樹(shù)脂的結(jié)合力也不同，隨著緩沖液中鹽濃度的增加或pH的變化，蛋白按結(jié)合力的強(qiáng)弱被依次洗脫。在工業(yè)化生產(chǎn)中更多地是改變鹽濃度而不是去改變pH值，因?yàn)榍罢吒菀卓刂啤Ｔ趯?shí)驗(yàn)室中幾乎總是用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱,利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升,當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí),蛋白就被從柱上洗脫下來(lái)。但在工業(yè)生產(chǎn)中鹽濃度很難精確控制，所以常用分步洗脫而不足連續(xù)升高的鹽梯度。與排阻層析相比，離子交換特異性更好。 江蘇蛋白純化什么是蛋白純化？你了解多少呢？

 影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時(shí)溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度比較低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(lái)（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。  

緩沖液的更換

雖然更換緩沖液不能提高蛋白純度，但它卻在蛋白純化方案中起著極其重要的作用。不同的蛋白純化方法需要不同pH及不同離子強(qiáng)度的緩沖液。假如你用硫酸銨將蛋白沉淀出來(lái)，毫無(wú)疑問(wèn)蛋白是處在高鹽環(huán)境中，需要想辦法脫鹽，可用的方法有利用半透膜透析，通過(guò)勤換透析液體去除鹽分，此法尚可，但需幾個(gè)小時(shí)，通常要過(guò)夜，也難以用予大規(guī)模純化中。新型的設(shè)備將透析膜夾在兩個(gè)板中間，板的一側(cè)加緩沖液，另一側(cè)加需脫鹽的蛋白溶液，并在蛋白溶液一側(cè)通過(guò)泵加壓，可以使兩側(cè)溶液在數(shù)小時(shí)內(nèi)達(dá)到平衡，若增加對(duì)蛋白溶液的壓力，還可迫使水分和鹽更多通過(guò)透析膜進(jìn)入透析液達(dá)到對(duì)蛋白濃縮的目的。也有出售的脫鹽柱，柱內(nèi)的填料是小孔徑的顆粒，蛋白分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，先于高濃度鹽離子從柱中流出，從而使二者分離。蛋白純化的每一步都會(huì)造成目的蛋白的丟失，緩沖液平衡的步驟尤甚。蛋白會(huì)結(jié)合在任何它能接觸的表面上，剪切力、起泡沫和離子強(qiáng)度的快速變化很容易讓蛋白失活。 蛋白質(zhì)分離純化的幾種方法。

其他純化方法

對(duì)于具有特殊性質(zhì)的蛋白，可以利用特殊的方法對(duì)其進(jìn)行純化，下面就一些蛋白的特殊性質(zhì)及純化方法做一介紹?？赡嫘跃喓希涸谀承┤芤簵l件下，有一些酶能聚合成二聚體、四聚體等，而在另一種條件下則形成單體，如相繼在這兩種不同的條件下按大小就可以進(jìn)行分級(jí)分離。

熱穩(wěn)定性：大多數(shù)蛋白質(zhì)加熱到 95℃時(shí)會(huì)解折疊或沉淀，利用這一性質(zhì)，可容易地將一種經(jīng)這樣加熱后仍保持其可溶性活性的蛋白質(zhì)從大部分其它細(xì)胞蛋白質(zhì)中分離開(kāi)。

蛋白酶解穩(wěn)定性：用蛋白酶處理上清液消化雜蛋白，可以純化得到具有蛋白酶解抗性的蛋白質(zhì)。

溶解度：影響蛋白質(zhì)溶解度的外界因素很多，如溶液的 pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等。在特定的外界條件下，不同的蛋白質(zhì)具有不同的溶解度。適當(dāng)改變外界條件，控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度從而將其從溶液中析出。 分子篩層析蛋白純化系統(tǒng)具有分子篩作用的物質(zhì)很多，如浮石、瓊脂、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。江蘇蛋白純化

在蛋白純化的過(guò)程中，防止蛋白降解的方法。江蘇蛋白純化

蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。 3、低溫有機(jī)溶劑沉淀法   用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。 （二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法 1、透析與超濾   透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)。   超濾法是利用高壓力或離心力，強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。 2、凝膠過(guò)濾法   也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物***的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。 （三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離 蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開(kāi)。 1、電泳法   

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