免疫組織化學(xué)的方法具有方便、快捷、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)并且對(duì)Lynch綜合征的確診具有指向性，因此被***接收，目前已幾乎替代前者。上述MSI的傳統(tǒng)檢測方法不能用于對(duì)Lynch綜合征的確診，而免疫組織化學(xué)方法因直接檢測相關(guān)蛋白對(duì)Lynch綜合征具有***的指向性。為了提高對(duì)Lynch綜合征的指向性，有學(xué)者建議將EpCAM列入錯(cuò)配修復(fù)蛋白檢測行列。然而對(duì)Lynch綜合征的確診必需依賴于對(duì)MLH1、MSH2、MSH6、PMS2以及EpCAM基因進(jìn)行突變或缺失的檢查結(jié)果。四、錯(cuò)配修復(fù)蛋白染色錯(cuò)配修復(fù)蛋白染色結(jié)果判斷應(yīng)注意以下幾點(diǎn):1）著色部位是否為核；2）內(nèi)對(duì)照（上皮細(xì)胞：正常腸上皮特別是腺體基底部細(xì)胞；間質(zhì)細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等）是否陽性；3）**細(xì)胞的細(xì)胞核是否為陽性（通常任何**細(xì)胞表達(dá)即判斷為該錯(cuò)配修復(fù)蛋白陽性）錯(cuò)配修復(fù)蛋白結(jié)果解讀:一種或多種錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失提示為MSI-H**。通常MLH1功能缺陷會(huì)合并PMS2表達(dá)缺失，而MSH2缺陷則常合并MSH6表達(dá)缺失，反之不然?！具~杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)】開發(fā)的dMMR抗體檢測試劑,檢測費(fèi)用低,技術(shù)成熟,臨床易開展。陜西定制dMMR抗體檢測試劑

    每孔加50μl含％abts(southernbiotech公司)和％h2o2的檸檬酸緩沖液()進(jìn)行顯色反應(yīng)，10-20min內(nèi)測定405nm波長下的od值。結(jié)果顯示，本發(fā)明單克隆抗體為igg2b型鼠源單克隆抗體。二、親和常數(shù)測定包被msh6重組蛋白，包被濃度為2μg/ml,100μl/孔，4℃包被過夜，pbs-t洗3次。每孔加200μl封閉液37℃封閉2h，pbs-t洗3次。實(shí)施例4中純化的單克隆抗體，從1：200開始2倍梯度稀釋，***1孔留空白對(duì)照，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。hrp標(biāo)記的羊抗鼠二抗1：20000稀釋，每孔100μl，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。每孔加入100μl含％tmb(sigma公司)和％h2o2的檸檬酸-磷酸緩沖液顯色10min，加50μ。用酶標(biāo)儀測定波長450nm的吸光值。畫出od值對(duì)應(yīng)抗體稀釋倍數(shù)的曲線，找出≥1/2“平臺(tái)od值”對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)a。利用下列公式計(jì)算出親和常數(shù)為×109。三、單抗反應(yīng)特異性和應(yīng)用效果選擇msh6重組蛋白，用免疫印跡的方法檢測本發(fā)明單克隆抗體的識(shí)別特異性，免疫印跡實(shí)驗(yàn)過程如下：每種蛋白上樣約5-10ng，進(jìn)行12％聚丙烯酰胺凝膠電泳。按常規(guī)方法在bio-rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中將凝膠蛋白帶轉(zhuǎn)移到pvdf膜上(millipore公司)。將膜置于含5％脫脂奶粉的tbs-t封閉液中4℃過夜。加入單克隆抗體msh6。陜西定制dMMR抗體檢測試劑邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)擁有豐富的伴隨診斷開發(fā)經(jīng)驗(yàn)，高質(zhì)量的管理體系和高素質(zhì)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)。

    對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前*常用的技術(shù)。本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點(diǎn)是：定位準(zhǔn)確，對(duì)比度好，染色標(biāo)本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標(biāo)方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，且隨著方法的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來越方便。目前在病理診斷中廣為使用的當(dāng)屬PAP法、ABC法、SP法等。3、免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。四、免疫組化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1、特異性強(qiáng)免疫學(xué)的基本原理決定了抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此。

    ％的MLH1啟動(dòng)子甲基化或MLH1表達(dá)缺失的結(jié)直腸ai中存在BRAF基因V600E突變，而且除極個(gè)別報(bào)道外，BRAF突變幾乎從不發(fā)生在Lynch綜合征相關(guān)結(jié)直腸ai中，因此檢測liu是否存在MLH1啟動(dòng)子甲基化和BRAF基因V600E突變可作為區(qū)分散發(fā)性MSI-H結(jié)直腸ai與Lynch綜合征相關(guān)結(jié)直腸ai的重要參數(shù)。2．MSI-H結(jié)直腸ai的臨床病理特征：Lynch綜合征相關(guān)性結(jié)直腸ai與散發(fā)性MSI-H結(jié)直腸的臨床病理特征大致相同。與MSS結(jié)直腸ai相比，MSI-H結(jié)直腸ai好發(fā)于右半結(jié)腸，組織學(xué)類型以黏液腺ai和低分化腺ai多見，liu內(nèi)有明顯的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(tumorinfiltratinglymphcytes，TIL)，較少見到腺腔內(nèi)壞死，liu邊緣呈膨脹性浸潤，周圍可見Crohn病樣淋巴細(xì)胞聚集(圖1)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率較低。相對(duì)于Lynch綜合征，散發(fā)性MSI-H結(jié)直腸ai發(fā)病年齡較大，女性相對(duì)多見，更易發(fā)生在右半結(jié)腸。圖1MSI-Hliu的形態(tài)特點(diǎn)；liu呈低分化或伴黏液分化，伴***的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(A，HE中倍放大)，liu前緣呈膨脹性浸潤，周圍見Crohn病樣淋巴細(xì)胞聚集灶(B，HE低倍放大)盡管MSI-H結(jié)直腸ai的病理特征與MSSliu存在一定差別，但除TIL外，其他形態(tài)指標(biāo)的特異性和敏感性均較低，即使結(jié)合發(fā)病年齡等因素(<60歲)。邁杰與大學(xué)，研究院所，醫(yī)院的科研人員進(jìn)行科研轉(zhuǎn)化研究合作,包括基礎(chǔ)科學(xué)研究及臨床應(yīng)用研究等。

    與無突變的結(jié)直腸ai相比，BRAF突變型CRC患者的年齡偏大，女性居多，微衛(wèi)星不穩(wěn)定可能性大、組織級(jí)別高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和局部晚期發(fā)生率高。術(shù)后輔助***后，BRAF突變型CRC的無病生存期更短，復(fù)發(fā)后的總生存期更差。PETACC-3研究檢測了1404例Ⅱ~Ⅲ期結(jié)腸ai患者的BRAF和KRAS突變，結(jié)果顯示，BRAF突變型患者的總生存劣于野生型患者。當(dāng)根據(jù)微衛(wèi)星不穩(wěn)定分層后，這種差異更加明顯。PETACC8和N0147試驗(yàn)的匯總分析提示W(wǎng)T組，BRAF突變組的中位SAR分別為，和，其中BRAF突變組（HR：：，P＜），提示BRAFV600E是TTR，SAR和OS的**預(yù)測因子。在以后的臨床試驗(yàn)輔助試驗(yàn)中應(yīng)將這些突變納入為重要分層因素。2.評(píng)估Lynch綜合癥Lynch綜合癥的機(jī)制通常是胚系MMR的缺失，SepulvedaAR等報(bào)道BRAFV600突變在胚系MMR缺失的患者中很少發(fā)生，但在具有表現(xiàn)得MMR缺失患者中被報(bào)道有高達(dá)3/4的患者具有BRAFV600E突變。因此BRAF突變可作為區(qū)分胚系與表現(xiàn)dMMR的手段，特別是MLH1缺失的情況下，進(jìn)一步評(píng)估Lynch綜合癥。三、MSI/MMR大量研究表明，微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）是由錯(cuò)配修復(fù)（MMR）基因發(fā)生缺陷引起的，當(dāng)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)功能異常時(shí)，微衛(wèi)星出現(xiàn)的復(fù)制錯(cuò)誤得不到糾正并不斷累積。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)圍繞生物標(biāo)志物研究、伴隨診斷開發(fā)，建立了完善的核酸組學(xué)、蛋白組學(xué)、細(xì)胞組學(xué)技術(shù)平臺(tái)。陜西定制dMMR抗體檢測試劑

經(jīng)多平臺(tái)平行驗(yàn)證（MSI-PCR、MSI-NGS)，一致性高，特異性好.陜西定制dMMR抗體檢測試劑

    3）當(dāng)樣本為MSH6或PMS2蛋白缺失的MSI-L時(shí)，可能是Lynch綜合征的罕見表型，建議進(jìn)一步確診。由于所有MMR蛋白的核染容易識(shí)別，且周圍間質(zhì)組織就可作為內(nèi)對(duì)照；同時(shí)IHC檢測具有操作簡單、價(jià)格便宜和可以迅速拿到檢測結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，所以目前IHC檢測已經(jīng)替代PCR檢測成為林奇綜合征的初步篩選方法，或在PCR檢測之后找出缺失的MMR蛋白。MSI對(duì)結(jié)直腸ai化療和預(yù)后的預(yù)測意義結(jié)直腸ai的化療而言，有大量的研究表明MSI狀態(tài)對(duì)于決定結(jié)直腸ai患者是使用5-FU***還是伊立替康***很重要。一項(xiàng)林奇綜合征患者長期隨訪的回顧性研究，根據(jù)MSI狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)，證實(shí)5-FU輔助***可使MSI-L和MSS患者生存得到改善。然而，在MSI-H患者術(shù)后5-FU輔助***并沒有顯示出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的效果，相反5年生存率低于那些*接受手術(shù)***的患者[11]。同時(shí)，MSI患者比起MSS患者對(duì)伊立替康的***更為敏感。根據(jù)上文所述，MSI的發(fā)生，與MMR基因缺失有關(guān)，因此NCCN結(jié)直腸ai小組建議計(jì)劃單獨(dú)使用5-FU進(jìn)行輔助***的Ⅱ期結(jié)直腸ai患者需進(jìn)行MSI檢測。結(jié)直腸ai的預(yù)后而言，一項(xiàng)匯集32項(xiàng)研究的薈萃分析表明：MSI患者生存期更長、病死率更低(不易發(fā)生liu復(fù)發(fā)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)[12]。鑒于MMR基因在結(jié)直腸ai***和預(yù)后方面的***影響。陜西定制dMMR抗體檢測試劑